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IMR-90細胞株 (細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種,分別是細菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染,那么他們污染細胞的特點分別是什么呢?怎樣能夠減少污染現(xiàn)象的發(fā)生?)
1-細菌
細菌污染常見的有大腸桿菌,葡萄球菌等。細菌污染較易發(fā)現(xiàn),在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀,培養(yǎng)液一般會在短時間內(nèi)變黃,有時靜置的培養(yǎng)液不混,稍加震蕩會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在,細胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。
處理:①在培養(yǎng)液中加入相應的抗生素,能夠預防絕大多數(shù)的細菌污染。
2-真菌
真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種,尤其梅雨季節(jié)快要到了,進行細胞培養(yǎng)時更易污染。污染細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見,較易被發(fā)現(xiàn),短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁,倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲,并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。
很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠;念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形,散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時,要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈,以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。
真菌污染后,細胞生長變慢,但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。真菌生長的比較慢,不象細菌那么容易被發(fā)現(xiàn),但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細胞就被污染了,也很難救活了。
3-支原體
支原體的大小介于細菌和病毒之間,是一種獨立生活的微生物。對熱敏感,對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變,多吸附在細胞表面和細胞之間。電鏡下觀察,中心有高密度的密集顆粒,橫斷面與細胞微絨毛相似。
因國內(nèi)的血清大多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測,而支原體又是牛血清中zui常見的微生物之一。支原體污染細胞后,培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁.但細胞變化不顯著,隨著細胞的培養(yǎng)會慢慢死亡。
支原體污染檢測(熒光染色法):DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合,使得支原體的DNA著色,然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。
解決:
1)抗生素排除法:支原體污染預防比解決好。如果不小心污染后,可加入高濃度抗生素(常規(guī)使用的5倍濃度)作用24-48小時,再換入常規(guī)培養(yǎng)液,但該法不保證有效。推薦用量:慶大霉素 200μg/ml ,四環(huán)素10μg/ml ,卡那霉素50μg/ml 。
2)加溫除菌:支原體不耐熱,可以對支原體污染的細胞熱處理除菌。因高溫對細胞本身也會產(chǎn)生一定影響,故熱處理前需先進行預實驗,確定對細胞影響zui小而能zui大程度的殺死支原體的時間。
4-黑膠蟲
黑膠蟲的存在目前尚有爭議,其在低倍下為黑色點狀,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,培養(yǎng)液也是不渾的,對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響,在細胞增殖旺盛之后會自然消失,除更換血清外無須特殊處理。
5-原蟲
培養(yǎng)液可輕微渾濁,顯微鏡下那些細小的點狀物數(shù)量非常多,輕微活動,細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,而且細胞狀態(tài)不好,邊緣不清楚,細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的,但他們的數(shù)量小,細胞站優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長,只有當他們到達一定的數(shù)量時就會影響到細胞的生長,zui終形成惡性循環(huán)。
6-病毒
組織細胞培養(yǎng)過程中,如果沒有除去潛在的病毒,就會產(chǎn)生病毒污染。目前,從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng),但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此,潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
7-非同種細胞污染
即細胞交叉污染,由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開,往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前,世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染,致使許多實驗宣告無效。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生,大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學物質(zhì)所致。
污染是細胞培養(yǎng)的大敵,預防和避免污染是成功培養(yǎng)細胞的關(guān)鍵之一。危機意識要貫徹實驗的始終,否則不僅浪費時間,而且浪費人力、物力,甚至造成無法彌補的損失。
(如何預防細胞培養(yǎng)的污染和清除這些污染物呢?)慧穎 細胞庫 技術(shù)為您解答:
一、污染的預防
預防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預防工作做在前,才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度。一般預防可從以下幾方面著手:
1-從操作者做起
1操作者責任心要強,要細心穩(wěn)重,操作技術(shù)要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,按規(guī)定穿隔離衣。進入后關(guān)好門,坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物,不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi),更不能隨便使用,以免造成大批污染。
2、操作者動作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話,若打噴嚏或咳嗽應轉(zhuǎn)向背面。
3、操作時要常更換吸管,切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾,保持實驗室清潔整齊,zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。
2-從物品、用品消毒滅菌著手
細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*,各種溶液滅菌除菌要仔細,并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。
3-防止細胞交叉污染
在進行多種細胞培養(yǎng)操作時,所用器具要嚴格區(qū)分,做上標記便于辨別。并按順序進行操作,避免一起進行時易發(fā)生混亂。
在進行換液或傳代操作時,注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口,以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。
所有細胞一旦購置,或從別處引入,或自己建立,均應及早留種凍存,一旦發(fā)生污染可棄之復蘇,重新培養(yǎng)。
二、污染的清除
培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染,多數(shù)較難處理。如果污染細胞價值不大,宜棄之;有細胞株留存的或可購置的,可在尋找原因后*消毒操作室,復蘇或重新購置細胞,再培養(yǎng)。若污染細胞價值較大,又難于重新得到,可采取以下辦法清除。
1-使用抗生素
抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL),污染后清除用藥需采用大于常用量5~10倍的沖洗法,于加藥后作用24~48小時,再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外,還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400~800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理,每隔2~3日換液1次,傳1~2代進行治療。近年來有報道,4-氟,2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250濃縮液,-20℃保存?zhèn)溆?,使用濃度Cip為10μg/mL,BM-1為10μg/mL,BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液,加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液,3天后再吸除培養(yǎng)液,加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)4天,如此連續(xù)3個輪次,直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。
2-使用支原體特異性血清
用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價1:320以上)可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩,不如用抗生素方便、經(jīng)濟。
3-加溫處理
將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時,可殺死支原體,但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行預試驗,摸索能zui大限度殺死支原體又對細胞影響zui小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后,再以41℃加溫處理效果更佳。
4-其他方法
除了上述去除污染的方法外,還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等,但均較麻煩,且效果不確定。所以一旦支原體污染,除非有特別重要價值,一般均棄之重新培養(yǎng)。
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