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人雌二醇 (E2) ELISA試劑盒
(德國DRG:EIA2693)
1、前言說明
E2是一種含一個(gè)酚A環(huán)的18C類固醇激素。此類固醇激素的分子量為272.4,它是人體中zui有效的雌激素,主要由女性卵巢的格拉芬卵泡和胎盤產(chǎn)生,少量由腎上腺和男性睪丸產(chǎn)生。E2(雌二醇)被分泌到血液中,在血液中有98%的雌二醇會(huì)結(jié)合到性激素結(jié)合蛋白上,有的還會(huì)結(jié)合到其它血清蛋白上(如血清白蛋白),只有很少一部分以游離形式存在。雌激素的活性會(huì)受到雌二醇受體符合物的影響,此符合物可在靶位并在核酸水平上引發(fā)相應(yīng)的反應(yīng)。這些靶位包括:卵泡、子宮、乳房、陰道、尿道、下丘腦、垂體和敏感稍低的肝臟與皮膚。在月經(jīng)周期正常的未懷孕女性體內(nèi),雌二醇的分泌遵循著一種循環(huán)模式,在排卵前有兩個(gè)明顯的高峰期。高濃度的雌二醇可在垂體水平發(fā)揮正反饋?zhàn)饔?,它?huì)影響垂體促性腺激素的分泌,如卵泡刺激素和黃體生成素,前者是卵泡成熟所必要的,后者是排卵形成所必要的。排卵后,雌二醇水平迅速下降直到黃體細(xì)胞被激活,結(jié)果雌二醇水平出現(xiàn)第二次高峰,并在黃體階段達(dá)到一平衡述評。在懷孕期間,母體血清雌二醇的水平會(huì)極度的增加,并且會(huì)超過排卵前的峰值,而且在整個(gè)孕期維持在高水平上。血清雌二醇的檢測是評價(jià)各種月經(jīng)功能障礙的一個(gè)有效指標(biāo),例如女性早熟和晚熟,原發(fā)性、續(xù)發(fā)性閉經(jīng)和絕經(jīng)癥。據(jù)報(bào)道,女性化綜合征、男子女性型乳房和睪丸癌患者的血清雌二醇水平會(huì)升高。在不孕患者體內(nèi),血清雌二醇的檢測有利于監(jiān)測藥物治療(如克羅米酚檸檬酸鹽、促黃體生成素釋放激素或外源性促性腺激素)后排卵的感應(yīng)情況。在因?yàn)轶w外受精而引起的卵巢過度刺激綜合征患者中,每天監(jiān)測血清雌二醇濃度以便為hCG的管理和卵母細(xì)胞的采集提供*時(shí)間。
2、檢測原理:
DRG公司的雌二醇酶免試劑盒是一種基于競爭法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合雌二醇分子上*抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性雌二醇的病人樣本與辣根過氧酶標(biāo)記的雌二醇競爭性的結(jié)合包被板上的抗體。溫育之后,未結(jié)合的酶聯(lián)物用洗滌液洗去。過氧酶與包被抗體的結(jié)合量與樣品中雌二醇的濃度成反比。加入底物液后,所顯示的顏色強(qiáng)度與病人樣品中雌二醇的濃度成反比。
3、試劑盒成分:
1) 包被板,12×8(可拆),96孔,微孔中包被了抗雌二醇的兔單克隆抗體。
2) 標(biāo)準(zhǔn)品:7支1.0ml/支。分別含量為:0;25;100;250;500;1000;2000pg/ml。 (1pg/ml=3.67pmol/L)
3) 酶聯(lián)結(jié)物:1支,25 ml,內(nèi)含辣根過氧化物酶標(biāo)記的雌二醇。
4) 底物液:1支,內(nèi)含,14ml ,內(nèi)含TMB
5) 終止液:1支,0.5M的 H2SO4,14ml,避免接觸終止液,以免造成刺激皮膚和著燒皮膚。
6) 洗滌液(40×),1支,30ml
注:用于樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品視需要而定。
4、實(shí)驗(yàn)需要器材(但試劑盒不提供)
1) 酶標(biāo)儀(450±10nm)。
2) 微量移液器和吸嘴 25μl、100μl、200μl。
3) 坐標(biāo)紙。
4) 去離子水。
5、試劑貯存:
未開啟的試劑在2—8℃下貯存時(shí),其活性在有效期內(nèi)穩(wěn)定,不要使用過期試劑。所有開封了的試劑都必須儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下,微孔反應(yīng)板也必須貯存于2—8℃的環(huán)境下。一旦包裝袋被打開,必須將它小心地嚴(yán)封起來。
6、試劑準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)開始前,將所有的試劑和所需數(shù)目的板條都平衡至室溫。
洗滌液:在30ml的濃縮洗滌液中加入1170ml去離子水進(jìn)行稀釋,稀釋好的洗滌液室溫下可穩(wěn)定存放2周。
7、樣本采集和準(zhǔn)備
7.1樣品的采集
血清:靜脈穿刺采集全血,待其凝血,室溫下離心獲取血清。
血漿:將全血收集到含抗凝劑的離心試管中,采集后立即離心。
7.2樣品的儲(chǔ)存
實(shí)驗(yàn)開始前,應(yīng)當(dāng)將樣品用蓋子蓋好,2-8℃環(huán)境下可穩(wěn)定存放5天。如果實(shí)驗(yàn)前想要將樣品存放更長的時(shí)間,則應(yīng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下。解凍的樣品在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)反復(fù)倒置幾次。
7.3樣品的稀釋
在*實(shí)驗(yàn)時(shí),如果血清樣品中睪酮的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品中睪酮的濃度,則應(yīng)將此樣品用零標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10或100倍,并按實(shí)驗(yàn)步驟重新檢測。在計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)當(dāng)將此稀釋因子考慮進(jìn)去。
例如:
a) 按1:10的比例稀釋:10μl的血清+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品(充分混合)
b) 按1:100的比例稀釋:10μl已稀釋好的a)+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品(充分混合)
8、實(shí)驗(yàn)步驟:
所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品都做雙份檢測以保證所有的檢測條件都相同。
1) 將所需數(shù)量的板條固定到板架上。
2) 將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應(yīng)的微孔中。
3) 在每一微孔中加入200μL酶聯(lián)物。
4) 充分混勻10秒,在這個(gè)步驟*混勻很重要。
5) 室溫孵育120分種。
6) 快速棄去孔內(nèi)反應(yīng)物,每孔用400μL洗滌液洗板3次,在吸水紙上拍干。注意:洗板步驟是否正確操作會(huì)明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和精確度。
7) 在每一微孔中加入100μl底物液。
8) 室溫孵育15分種。
9) 加50μl終止液到每個(gè)檢測孔中終止酶反應(yīng)。
10) 加終止液后10分鐘之內(nèi),用酶標(biāo)儀在450±10nm處測定OD 值。
9、結(jié)果計(jì)算:
1) 計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。
2) 用吸光度值作為縱坐標(biāo)(y),濃度值作為橫坐標(biāo)(x),以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪,作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3) 用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。
4) 自動(dòng)計(jì)算方法:在IFU上,它用四參數(shù)曲線已自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會(huì)得出稍微不同的結(jié)果。
5) 樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計(jì)算樣品濃度時(shí)就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。
10、參考值
我們強(qiáng)烈建議各個(gè)實(shí)驗(yàn)市都建立自己的正常值和異常值。在一明顯正常人群的研究中,我們使用DRG公司的雌二醇ELISA試劑盒進(jìn)行檢測得到如下結(jié)果:
人群 | 5-95% |
男性 | 10-36pg/ml |
女性 絕經(jīng)期前 絕經(jīng)期后 |
13-191pg/ml
11-65pg/ml |
本譯文僅供參考,詳情請以原文為準(zhǔn)。
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