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Abcam抗體之Western Blot條帶分析

發(fā)布時(shí)間:2016-07-11瀏覽:2446次

美國*Abcam一抗,小包裝規(guī)格抗體,二抗

Abcam位于英國的劍橋科學(xué)園,由Jonathan Milner于1998年創(chuàng)立,專門生產(chǎn)和分銷研究型抗體,是世界上zui的抗體供應(yīng)商之一。目前Abcam在線目錄上列舉的抗體和試劑已超過120,000種。

Western Blot結(jié)果條帶全面分析:

慧穎生物為您介紹分析Western Blot中結(jié)果條帶的各種稀奇古怪。

啥也沒有

原因:比較多,如果單純一張沒有任何顯色的X光片,zui可能是一抗加成其他抗體,或者二抗種屬加錯(cuò)了,比如兔的加成鼠的。

解決辦法:仔細(xì)檢查抗體是否加錯(cuò),確認(rèn)轉(zhuǎn)膜沒有問題。

經(jīng)驗(yàn):上面的圖片展示的是一點(diǎn)信號(hào)都沒有,如果是這樣大部分情況是抗體加錯(cuò)了。如果中間出現(xiàn)了細(xì)微的條帶,可能原因是蛋白上樣量太少,一抗?jié)舛冗^低,ECL發(fā)光液失效。另外如果轉(zhuǎn)膜出現(xiàn)了問題,比如膜放反了,自然是一個(gè)白片。

高背景

原因:封閉不夠好,一抗?jié)舛雀?,洗膜時(shí)間和次數(shù)不夠

解決辦法:降低一抗?jié)舛龋黾酉茨r(shí)間和次數(shù)。

經(jīng)驗(yàn):高背景可能是WB中zui常見出現(xiàn)的問題,目的條帶單一清晰,但是其他地方又彌漫性較為均一的背景(比較連續(xù)的)。其實(shí)只要我們注意操作規(guī)范,不偷工減料就很容易避免,洗膜按照規(guī)定來5min*5次或者10min*3次,不要改成5min*3次,或者10min*2次。

非特異性條帶

原因:一抗非特異性與蛋白結(jié)合

解決辦法:更換一抗

經(jīng)驗(yàn):此種情況絕大多數(shù)是因?yàn)橐豢共缓?,你無法判斷那一條是目的條帶。如果實(shí)在沒有更好的抗體,建議采用陰性對(duì)照和陽性對(duì)照來確定上述哪個(gè)條帶是目的條帶。當(dāng)然這種情況下有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y(jié)合。

條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈

原因:電轉(zhuǎn)中膜和膠之間存在氣泡。

解決辦法:轉(zhuǎn)膜前去掉膜和膠之間的氣泡

經(jīng)驗(yàn):我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個(gè)盤子里,倒入的液體不能太多也不能太少,的高度是與放上*層濾紙齊平,然后往濾紙上澆點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液,把電泳膠用清水清洗下,將電泳膠平鋪到濾紙上,仔細(xì)檢查濾紙與膠之間是否有氣泡,可以左右前后觀察,不同方向觀察之后確認(rèn)無氣泡,然后再往膠上面澆點(diǎn)電轉(zhuǎn)液,用兩只手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側(cè)中間,使膜成U型,然后將U型的底部接觸膠的中間,慢慢往兩邊放下膜,這樣一般氣泡很少。然后上層濾紙同樣用U型的放置方法,用玻璃棒稍微貼實(shí)下,然后蓋上海綿。注意不要來回趕氣泡,這樣反而會(huì)帶入氣泡。

條帶中間出現(xiàn)白色(反白)

原因:中心部位高濃度HRP把底物消耗過快,中間部位底物消耗結(jié)束之后就不發(fā)光了

解決辦法:降低蛋白量,降低一抗和二抗的濃度。

經(jīng)驗(yàn):如果你足夠迅速,可以在中間部位底物消耗之前就把X光片給定影出來,但是時(shí)間很難把握,建議還是從降低蛋白量,降低一抗二抗?jié)舛热胧帧?/span>

出現(xiàn)黑點(diǎn)和黑斑

原因:膜上其他部位與一抗或者二抗非特異性結(jié)合

解決辦法:封閉牛奶一定要純,封閉結(jié)束之后要洗

經(jīng)驗(yàn):我們常常是等到要封閉的時(shí)候發(fā)現(xiàn)沒有牛奶,然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置,配的匆忙的時(shí)候往往不管是否已經(jīng)*溶解,如果沒有*溶解的情況下加牛奶倒膜上,會(huì)導(dǎo)致很多不溶性顆粒附著在膜上,這就會(huì)導(dǎo)致發(fā)光時(shí)候膜上的黑點(diǎn)。所以牛奶溶解之后,靜止一下,然后輕輕地吸取上層牛奶進(jìn)行封閉,封閉結(jié)束之后一定要洗三遍之后再加一抗。

條帶拖尾

原因:蛋白量太大,一抗?jié)舛群蜁r(shí)間太長

解決辦法:根據(jù)情況調(diào)整蛋白量,同時(shí)一抗?jié)舛群蜁r(shí)間也可以縮短。

經(jīng)驗(yàn):這種情況很容易出現(xiàn),因?yàn)楹芏嘣蚨伎赡軐?dǎo)致這一個(gè)結(jié)果。一般來說,蛋白量都是我們經(jīng)過很多次摸索得出的zui適蛋白量,因此不太可能是蛋白量過多引起的。zui有可能的是因?yàn)橐豢節(jié)舛忍?,作用時(shí)間太長引起的。另外洗一抗和洗二抗千萬不要偷工減漏,建議5min*5次,不要但是洗這么多次就把抗體和蛋白洗掉了,你又不是拿刀在上面刮,真正的抗原抗體的結(jié)合是通過這種方式洗不掉的。

出現(xiàn)重影

原因:熒光強(qiáng)度比較高,在壓片時(shí),放好之后不小心又輕微移動(dòng)了一段距離

解決辦法:X光片放上去之后,就不要?jiǎng)恿?,即使放歪了也沒關(guān)系。

經(jīng)驗(yàn):有的時(shí)候出現(xiàn)重新剛好在上下位置,并且重影會(huì)相對(duì)弱一些,不要誤以為抗體識(shí)別了該蛋白的另外一種異構(gòu)形式。

出現(xiàn)非均一性背景

原因:膜可能曾經(jīng)干過

解決辦法:在每一步的操作過程中,都需要注意不要讓膜干

經(jīng)驗(yàn):在封閉的時(shí)候,洗一抗,洗二抗,以及發(fā)光的時(shí)候都時(shí)刻需要注意蛋白面不要風(fēng)干,風(fēng)干之后結(jié)果很可能就是這個(gè)樣子。注意與高背景區(qū)別。

某個(gè)條帶變形

原因:SDSPAGE膠中存在氣泡或者某不溶性顆粒

解決辦法:配膠過程中要小心,使用無雜質(zhì)的液體。

經(jīng)驗(yàn):很多實(shí)驗(yàn)室中使用的不是的設(shè)備,比如配膠用的海綿墊,如果用了很多年之后,會(huì)從下面往上面漏小氣泡,當(dāng)氣泡足夠小并且膠快凝固的時(shí)候,走到中間的小氣泡就停留在膠內(nèi),并會(huì)影響到后面的跑膠。另外配膠用的水,SDS,Tris緩沖液要注意不要有雜質(zhì)。

條帶呈啞鈴狀

原因:配置膠有問題

解決辦法:把膠配好,不合格的膠堅(jiān)決不用

經(jīng)驗(yàn):出現(xiàn)啞鈴zui大的可能是膠沒有配置好,膠凝固后不均一,不知道大家有沒有出現(xiàn)如下的配膠情況,下圖中示意拔完梳子之后的結(jié)果,如果你拔完梳子之后出現(xiàn)圖中下面部分的樣子,多半會(huì)出現(xiàn)啞鈴狀。另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質(zhì),沒有離心下來,然后雜質(zhì)沉積在孔的中間,蛋白自然被推擠到兩邊。

zui邊緣條帶彎曲

原因:電泳電流不均一

解決辦法:換用新的電泳槽; 不使用兩邊的兩孔

經(jīng)驗(yàn):一般我們使用的是10孔的的膠,如果你上樣剛好10個(gè)孔,那么zui兩頭的兩個(gè)孔肯定會(huì)歪曲。另外上樣在膠的中間,這樣電場(chǎng)均一。

其他問題

(1)蛋白分子量偏高或者偏低。可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對(duì)應(yīng),比如說100KD的蛋白你用12%的膠跑,或者說20KD的蛋白你用6%的膠跑。

(2)蛋白質(zhì)降解。蛋白質(zhì)降解后很可能會(huì)在比原來位置低的地方出現(xiàn)主帶,然后會(huì)出現(xiàn)一些其他帶,zui主要特點(diǎn)是所有的條帶比正常的都低,并且條帶模糊不清晰。

(3)所有條帶連成一片沒有間隔。原因zui可能是上樣量過多,其次是樣品彌散(比如電泳長時(shí)間停止樣品彌散)。

電泳過程中出現(xiàn)現(xiàn)象及問題

(1)整個(gè)條帶呈 “ ︶ ” 狀:凝膠冷卻不均一,電泳槽老化。

(2)整個(gè)條帶呈“ ︵ ”: 凝膠左右兩頭沒有凝固好

(3)溴酚藍(lán)拖尾:樣品溶解不好。

(4)縱向的紋理:上樣樣品中存在不溶性顆粒

(5)溴酚藍(lán)很粗:濃縮膠濃縮效果不好,可能是濃縮膠太短,或者是濃縮膠配錯(cuò)。

(6)在分離膠中跑不動(dòng):Tris-Cl PH值不對(duì),或者忘記加SDS。

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