檢測口蹄疫血清抗體的方法

   （一）口蹄疫正向間接紅細胞凝集試驗（間接血凝試驗）

    該試驗是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和豬水泡病病毒的細胞培養(yǎng)物（細胞毒）經(jīng)PEG濃縮，蔗糖密度梯度超離后純化的病毒抗原分別致敏戊二醛鞣酸處理的綿羊紅細胞，而制成的血凝抗原，用于快速檢測動物血清中的口蹄疫和豬水泡病特異抗體水平。

 該法簡易、快速、特異、直觀、是當前測抗的實用方法。

1． 試驗材料    V型96孔110^。醫(yī)用血凝滴定板 、玻璃板（與血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振蕩器、1毫升/5毫升 刻度玻璃吸管、玻璃中試管（內(nèi)徑1.5毫米，長度100毫米）、鋁質(zhì)試管架（40孔）、口蹄疫各型和豬水泡正向間接血凝診斷液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型陽性血清、SVD陽性血清、陰性血清、稀釋液。

 2．試驗方法 根據(jù)試驗目的可分為用于鑒別診斷；用于監(jiān)測疫苗接種動物的抗體水平的檢測方法。

1. 疫苗接種動物抗體水平監(jiān)測方法

 接種何種疫苗就使用何種正向血凝診斷液。

    ①稀釋待檢血清  在血凝板上1~8孔各加稀釋液50微升，取待檢血清50微升加入第1孔，混勻后從中取出50微升加入第2孔，混勻后從中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混勻后從該孔取出50微升 丟棄，保持每孔50微升的劑量。此時1~8孔的血清稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。

②稀釋陰性對照血清  取中試管1支加稀釋液1.5毫升，再加陰性血清0.1毫升，充分搖勻陰性血清的稀釋度即為1：16。

③稀釋陽性對照血清  取中試管5支，第1管加稀釋液3.1毫升，第2~5管分別加稀釋液0.5毫升，取陽性血清0.1毫升 加入第1管混勻后從中取出0.5毫升，加入第2管混勻后從中取出0.5毫升，加入第3管……直至第5管，此時各管陽性血清的稀釋度低次為1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。 

   ④滴加對照孔  取1：16稀釋的陰性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀釋的陽性血清50微升加入第11孔；取稀釋液50微升加入第12孔。

    ⑤滴加正向血凝診斷液   取正向血凝診斷液充分搖勻（瓶底應無血球沉淀），每孔各加25微升后立即置微量振蕩器上振蕩1分鐘，取下血凝板放在白紙上觀察每孔中的血球是否均勻（孔底應無血球沉淀）。如仍有部分孔底出現(xiàn)血球沉積，應繼續(xù)振蕩直至*混勻為止。

⑥靜置   將血凝板放在室溫下（15~30℃）靜置2h后判定檢測結(jié)果，若結(jié)果不清晰或來不及判定，也可放置第2天判定。

   ⑦判定標準   先觀察10~12孔（對照孔），第10孔為陰性血清對照，應無紅細胞凝集現(xiàn)象，紅細胞全部沉入孔底，形成小園點或僅有25%紅細胞有凝集（“+"的凝集）；第11孔為陽性血清對照，應出現(xiàn)“++"以上的凝集（50%以上的紅細胞發(fā)生凝集），證明該批正向診斷液的效價達到1：512為合格；第12孔為稀釋液對照，紅細胞也應全部沉入孔底或只有“+"的凝集。

    在上述對照合格的前提下，觀察待檢血清各孔，以出現(xiàn)“++"凝集的待檢血清zui大稀釋度為其抗體效價。例如檢測接種口蹄疫O型滅活疫苗的豬群免疫水平時，某份血清1-7孔出現(xiàn)“++"或“++"以上（+++~#）凝集而第8孔僅有“+"凝集，判定該份血清中的O型抗體效價為1：128。

    經(jīng)實驗室測定，口蹄疫O型滅活疫苗的免疫豬群血清中O型抗體效價達到1：128及其以上時，豬群可耐受20個O型強毒發(fā)病量的人工感染。

   （2）用于鑒別診斷的正向間接血凝試驗

①稀釋待檢血清  取中試管8支列于試管架上，第1管加稀釋液1.5毫升，第2~8管各加稀釋液0.5毫升，取待檢血清0.5毫升 加入第1管混勻后從中取出0.5毫升加入第2管……直至第8管，待檢血清的稀釋度依次為1:4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

②稀釋陰性對照血清   取中試管1支加稀釋液1.5毫升，再加陰性血清0.1毫升 ,即成1：16。

    ③稀釋陽性對照血清   取中試管5支，列于管架上，每管加稀釋液4.9毫升陽血，依次用記號筆標明O、A、C、Asia型和SVD陽血，分別取這5種陽性血清10微升加入相應的試管中（注意每加一種陽性血清，必須單獨使用一根吸管），蓋上橡膠塞充分搖勻，陽性血清的稀釋度即成1：500。

    ④滴加待檢血清和對照血清  取第8管待檢血清加入血凝板上的1~5排第8孔，取7管血清加入1~5排的第7孔，取第6管血清加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔 50微升。取陰性血清（1：16稀釋度）加入1~5排的第10孔，每孔50微升。取1：500稀釋的陽性血清加入1~5排的第11孔，每孔50微升。取稀釋液加入1~5排的第12孔，每孔50微升。

⑤滴加正向間接血凝抗原（正向診斷液） 第1排1~8孔和10~12孔加O型血凝抗原，每孔25微升。第二排1~8孔和10~12孔加A型血凝抗原，每孔25微升。第三排1~8孔和10~12孔加C型血凝抗原，每孔25微升。第四排1~8孔和10~12孔加Asia-1型血凝抗原，每孔25微升。第五排1~8孔和10~12孔加SVD血凝抗原，每孔25微升。加畢抗原后立即將血凝板置于微量振蕩器上中速振蕩1分鐘，使抗體和抗原充分混勻，各孔不應有紅細胞沉淀。

⑥靜置  從振蕩器上取下血凝板，放在試驗臺上，蓋上玻板，室溫（15~30℃）靜置2小時，判定結(jié)果，若結(jié)果不清晰或來不及判定，也可放置第2天判定。

⑦判定標準  先仔細觀察每排的10~12孔，10孔為陰性血清對照，12孔為稀釋液對照，這2孔均應無凝集現(xiàn)象，或僅出現(xiàn)“+"的凝集。11孔為口蹄疫4個型和豬水泡病1：500稀釋的陽性血清對照，應出現(xiàn)“++" ~ “+++"的凝集，證明所使用的5種血凝抗原試劑合格。

    在對照孔符合上述標準的前提下，觀察1~5排的第1~8孔，某排1~8孔，出現(xiàn)“#"~“++"的凝集，其余4排僅在1~3孔出現(xiàn)“++"~“+"的凝集，便可判定該份待檢血清為陽性，其型別與所加的血凝抗原的型別相同。例出第1排的1~3孔出現(xiàn)“#"凝集，第4-5孔出現(xiàn)“+++"凝集，第6孔出現(xiàn)“++"凝集，第7孔出現(xiàn)“+"凝集，第8孔無凝集（“—"），判定該份待檢血清為口蹄疫O型，表明血清中存在O型抗體其效價為1：128。如果該份血清采自口蹄疫O型疫苗免疫過的動物，就不能判定究竟是自然感染產(chǎn)生的抗體，還是接種過疫苗產(chǎn)生的抗體。因為本法尚不能區(qū)分感染性抗體和免疫性抗體。為此，欲使本法用于鑒別診斷，采血時必須要弄清該批動物是否接種過口蹄疫或豬水泡病疫苗。

    ⑧注意事項

A．嚴重溶血和污染的血清樣品不宜檢測，以免產(chǎn)生非特異反應。

B．勿用90^o和130^o血凝板，以免誤判。

     C．有時會出現(xiàn)“前帶"現(xiàn)象，即第1~2孔紅細胞沉淀而在第3~4孔又出現(xiàn)凝集，這是由于抗原抗體比例失調(diào)所致，不影響結(jié)果的判定。

D．血清必須是來自康復動物，至少是發(fā)病后10天的血清，否則不易檢出。

     注：稀釋液配方如下：

      Na₂HPO4·12H₂O  (磷酸氫二鈉)      35.8克

      Na₂H₂PO4·2H₂O  （磷酸二氫鈉)      1.56克

      NaCl           （氯  化  鈉）      8.5克

      NaN₃           （迭  氮  鈉）      1.0克

    加雙蒸水或去離子水至1 000毫升，15磅高壓滅菌20分鐘，冷卻后取出980毫升加正常兔血清20毫升即成，置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｔ撆浞竭m用于正向間接血凝試驗和反向被動血凝試驗，也適用于豬瘟間接血凝試驗。

正向間接血凝抗原及其配套試劑由中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫綜防研究組提供。

   （二）口蹄疫中和試驗

病毒或毒素與相應抗體結(jié)合后，能使其失去對易感動物的致病力或?qū)毎母腥玖?，稱為中和試驗，中和試驗不僅可在易感的實驗動物體內(nèi)進行，亦可在細胞培養(yǎng)或雞胚中進行。

1．細胞中和試驗

一般采用固定病毒稀釋血清法，該法須在無菌條件下操作，亦須細胞適應毒。

   （1）取兩列無菌試管，*列為正常血清對照組，第二列為待檢血清中和組。先在二列試管中的第1管加含有0.5%水解乳蛋白的漢克氏液（乳白液）3毫升；第2~6管各加乳白液2毫升。

   （2）取正常血清1毫升加入*列的第1管，取待檢血清1毫升加入第二列的第1管，混勻后，以同法對倍稀釋，1~6管的正常和待檢血清稀釋度依次為1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128。

   （3）二列試管中的1~6管分別加入 200TCID₅₀細胞適應毒2毫升 充分搖勻，置37℃水浴中保溫60分鐘。

   （4）取各稀釋度的血清分別接種3瓶長滿單層的細胞，傾去舊的細胞營養(yǎng)液，每瓶接種1毫升，置37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3天，每日鏡檢一次并詳細記錄細胞病變情況。

   （5）細胞培養(yǎng)3天后判定結(jié)果，正常血清對照組的細胞應全部出現(xiàn)病變；中和組的血清1：8以上無細胞病變，判為陽性。1：8的血清出現(xiàn)細胞病變則判為陰性，該法特異性強，結(jié)果可靠，但要求無菌設備和培養(yǎng)細胞的條件，操作繁瑣，基層難以應用。

2．乳鼠中和試驗

5~7日齡小白鼠對人工接種口蹄疫病毒易感染，產(chǎn)生特征性癥狀和規(guī)律性死亡。因此利用這一特性進行乳鼠中和試驗。操作步驟如下：

（1） 將待檢血清用生理鹽水或pH7.6的0.1M PBS稀釋成1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，分別與等量的10^-3口蹄疫乳鼠適應毒混合，37℃水浴保溫60分鐘。

（2） 每次試驗應設陰性血清（1：8）與10^-3病毒的混合液作為病毒對照；已知陽性血清與10^-3病毒的混合液作為陽性對照，處理方法同（1）步驟。

（3） 每一稀釋度血清中和組分別于頸背皮下接種5~7日齡乳鼠4只，對照組接種2只，0.2毫升/只，由母鼠哺乳，觀察5天判定結(jié)果。

    （4）判定標準  先檢查對照鼠，陰性對照鼠應于48小時內(nèi)病死；陽性對照鼠應健活。待檢血清任何一組的乳鼠健活或僅死二只，判定該份血清為陽性。以能保護50%接種乳鼠免遭病毒感染的血清zui大稀釋度為乳鼠中和效價。

    該法特異性強，結(jié)果可靠，簡單易行，基層可采用。但存在需時較長，乳鼠易被母鼠所吃或咬死，敏感性低等缺點。

（三）口蹄疫乳鼠保護試驗

    待檢血清稀釋成1：5，接種乳鼠后12小時或24小時，用10^-3病毒攻毒，同時設陰性血清和已知陽性血清（均為1：5稀釋）作為對照。觀察5天后判定結(jié)果。在陰性和陽性血清對照成立的前提下，待檢血清組的乳鼠健活，判定該份血清為陽性，反之，則判為陰性。

該法多用于定性檢測，一般不作為定量檢測手段。

（四）口蹄疫瓊脂擴散試驗

抗原抗體在瓊脂凝膠中，各以其固有的擴散系數(shù)擴散，當二者相遇時，在比例適當處發(fā)生結(jié)合而形成肉眼可見的沉淀帶。

操作步驟如下：

1．稱取瓊脂糖或瓊膠素1 克 ,迭氮鈉1克，氯化鈉 0.85克加pH7.6的0.01M PBS 100毫升。置沸水中煮熔化或15磅高壓10分鐘。趁熱傾入平皿中，厚度3~4毫米。

2. 瓊脂冷卻凝固后，用打孔器打成中央一孔周圍6孔的梅花形孔；中央孔徑4~5毫米，周圍孔徑3毫米與中央孔的孔距3~4毫米。

3.中央孔加已知型別的濃縮抗原，四周孔加不同稀釋度的待檢血清和陰性、陽性對照血清（1：2稀釋），靜置擴散1小時。

4. 移入濕盒內(nèi)于室溫或在37℃溫箱內(nèi)自由擴散3~5天，也可放置于4~6℃冰箱內(nèi)擴散。

5. 判定標準：出現(xiàn)沉淀線判陽性，反之，則判為陰性。

該法無需特殊儀器，設備通常用于定性檢測，但需時間長，敏感性差，漏檢率高。

   （五）口蹄疫微量補體結(jié)合試驗

    1．在U型24孔或96孔微量滴定板上每孔滴入生理鹽水100微升。

    2．每孔滴入一份經(jīng)過56℃滅活30分鐘的待檢血清25微升。

  3．每板設已知陰性、陽性血清2孔對照（與待檢血清試驗條件相同）。

  4．每孔滴入口蹄疫標準抗原25微升。

  5．每孔滴入補體工作濃度50微升。振蕩30秒，37℃溫箱保溫40分鐘。

  6.每孔加溶血素工作濃度 25微升和2%綿羊紅細胞 25微升，振蕩30秒于37℃下保溫30分鐘。

    判定結(jié)果，陰性對照血清孔應*溶血；陽性血清對照孔應不溶血為合格。凡*溶血的待檢血清判為陰性；凡不溶血的待檢血清判為陽性。

 該法特異性強，但敏感性低，適用于定性檢測。 

（六）口蹄疫對流免疫電泳

1. 電泳槽內(nèi)的緩沖液為巴氏妥——巴氏妥鈉緩沖液。

2. 1克 瓊脂糖加pH7.6的0.1M PBS 100毫升加熱熔解后澆灌在5×13厘米玻板上厚度為0.6~0.8毫米，冷卻凝固后用打孔器制成二排孔，其距離為3~4毫米，每5對孔為一組，組間距離為10毫米。

3. 每組左邊孔，分別加O、A、C、Asua-1型和SVD濃縮抗原，每組右邊孔加1：2的待檢血清。每次試驗應設陰性、陽性血清對照，抗原孔邊用濕濾紙搭橋接陰極；血清孔邊用濕濾紙搭橋接陽極。電壓為80-110V，電流強度為15mA，電泳90分鐘后取出凝膠板，并置于濕盒內(nèi)37℃放置3~4小時判定結(jié)果。

4. 先檢查對照孔，陰性血清應無沉淀線；陽性血清應出現(xiàn)清晰的沉淀線。凡與標準抗原對應孔的中間形成沉淀線的待檢血清判為陽性，其型別與標準抗原的型別相同，反之，則判為陰性。

該法較瓊擴靈敏度高，適用于大批血清樣品的檢測。