葡聚糖凝膠層析

【實驗?zāi)康摹?/strong>

1.掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。

2．學習葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù)。

【實驗原理】

凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析分離技術(shù)，這一技術(shù)為純化蛋白質(zhì)等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。層析的固定相載體是凝膠顆粒，目前應(yīng)用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。

    葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3—氯1，2—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密；交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)就越疏松，網(wǎng)孔的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍。可分離的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。

    葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過柱，各個組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動。分子量大于允許進入凝膠網(wǎng)孔范圍的物質(zhì)*被凝膠排阻，不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動，因此流程短，而先流出層析柱；分子量小的物質(zhì)可*進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長，而zui后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于*排阻和*進入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達到分離目的。

    本實驗以葡聚糖凝膠G—25作為固定相載體，來分離藍色葡聚糖—2000和溴酚藍。藍色葡聚糖—2000分子量接近2×10⁶， 而溴酚藍分子量為670，二者分子量相差較大，前者*排阻，而后者則可*進入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，二者通過層析柱的時間不同而分開。

【實驗材料】

1.實驗器材

層析柱(1×20cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1)；試管及試管架；量筒10m1；721型分光光度計

2.實驗試劑

   (1) Tris—醋酸緩沖液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用濃醋酸調(diào)pH至7.0，加蒸餾水至1000m1。

   (2) 溴酚藍溶液：稱取溴酚藍10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分攪拌使其溶解，然后逐滴加入Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍色。

   (3) 藍色葡聚糖—2000溶液：稱取藍色葡聚糖—2000  10毫克，溶于2毫升Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)中即成。

   (4) 樣品溶液：取溴酚藍溶液0.1毫升，藍色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混勻后為上柱樣品溶液。

   (5)葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex-G-25)

【實驗操作】

1.實驗?zāi)z的制備：商品凝膠是干燥的顆粒，使用時需經(jīng)溶脹處理，稱取4克葡聚糖凝膠G—25，加50毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時，或沸水浴溶脹 2小時，一般采用后一種方法。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細小顆粒，用蒸餾水反復洗滌幾次，再以緩沖溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗滌2—3次，使pH和離子強度達到平衡，zui后抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，凝膠可保存在緩沖液內(nèi)。

    2.裝柱：將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，選擇有薄膜端作為層析柱下口，將下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。層析柱中加入洗脫液，打開下口螺旋夾，讓溶液流出，排除殘留氣泡，zui后保留約2厘米高度的洗脫液，擰緊螺旋夾。將凝膠輕輕攪動均勻，用玻璃棒沿層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過l厘米時，打開下口螺旋夾，繼續(xù)裝柱至柱床高度達到8厘米,關(guān)閉出口。裝柱過程中嚴禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完，避免出現(xiàn)分層。再用洗脫液平衡l至2個柱床體積，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。平衡后，擰緊下端螺旋夾。

3.加樣品：打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出，直至床面與液面剛好平齊為止，關(guān)閉下端出口。取溴酚藍及藍色葡聚糖—2000混合液0.3毫升，小心地加于凝膠表面上，切勿攪動層析柱床表面。打開下端出口，使樣品溶液進入凝膠內(nèi)，并開始收集流出液。當樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時，關(guān)閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次，每次清洗液應(yīng)*進入凝膠柱內(nèi)后，再進行下一次洗滌。zui后在凝膠表面上加入洗脫液，保持高度為3—4cm。

    4.洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘1毫升，進行洗脫。仔細觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集3毫升即換一支收集管(試管預(yù)先編號)，收集約20管左右，樣品即可*被洗脫下來。將各收集管中的洗脫液分別用721型分光光度計在波長540nm處測定其光密度。

    5.凝膠回收處理方法：將樣品*洗脫下來后，繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。

 2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，zui后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。
   3 Sephadex LH20 洗脫溶劑。
看完第2點后，就應(yīng)該清楚Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類：反相和正相兩種。用得zui多的是反相溶劑洗脫，以甲醇--水系統(tǒng)zui為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，zui后用100％甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿--甲醇zui為常見，先用50％氯仿--甲醇，逐漸增加甲醇比例，zui后用100％甲醇沖柱。
   4 Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。
如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇--水），樣品用zui少體積的甲醇--水（盡可能甲醇少一些）溶解，過濾后，濕法上樣（一定要濾喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿--甲醇），樣品用zui少體積的氯仿--甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。
   5 Sephadex LH-20的步驟。
(1) 選擇條件：
梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。
(2) 飽和層析柱：
用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時要防止氣泡留在其中。至少半小時打開開關(guān)，流出幾個柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。
(3) 樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。
(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。
(5) 洗脫：控制流速，一般1drop/s以下，可參見廠家的一些參數(shù);必要時更改極性（很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢）。
再生以備下次使用。
   6 分離的技巧，zui后說說我的使用心得
（1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達。
（2）柱子盡可能長， Sephadex LH20 柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢兵力，打擊敵人。
（3） 餾分一定要接的細，可1／10，或1／20 個保留體積接成一餾分。
（4） 洗脫體積一般為2-3個保留體積，對特殊保留強的化合物，可洗脫5個保留體積。
（5）鞣質(zhì)成分死吸附嚴重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣質(zhì)
（6）Sephadex LH20 對黃酮類成分的分離效果，方法很成型，有大量文獻參考。
（7）填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。

   Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產(chǎn)物在有機溶劑中的純化。例如：類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等，Pharmadex LH-20同時適用于分子類別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規(guī)模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于zui終精制步驟，如非對映同分異構(gòu)體的分離。
   1.裝柱
裝填的重要原則之一就是需要形成一個穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄），越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒徑范圍相對于許多用于制備色譜的填料而言，不能說分布均一，也就是說其粒徑分布較寬。然而當膠溶脹后就相對容易得到均一的柱床。這對于長柱（zui高至250cm）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲槽都必須進行*的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必須進行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分攪拌，否則會破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。
在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，請參考后頁之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時，懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠粒可移動。將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。
    2.平衡
上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止，如改變?nèi)軇?yīng)該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì)，并根據(jù)性質(zhì)確定柱高調(diào)節(jié)器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。
    3.洗脫液
為確保延長層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾以除去雜質(zhì)。
    4.樣品
樣品體積應(yīng)該占柱總體積的1-2%，同樣在使用之前樣品應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾。
    5.洗脫
洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定，zui大線性流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1-10cm/h。總體來說，較低的流速，具有較高的分辯率。