小鼠Runt相關轉錄因子2 (RUNX2)試劑盒說明書

                                                                                                        （本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!）

試劑盒組成：

*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗小鼠RUNX2抗體包被于酶標板上，實驗時標本或標準品中的RUNX2會與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠RUNX2抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素?？?/span>小鼠RUNX2抗體與結合在包被抗體上的小鼠RUNX2結合、生物素與親和素特異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下現(xiàn)藍色，加終止液后變黃。用酶標儀在450nm波長處測OD值，RUNX2濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過繪制標準曲線求出標本中RUNX2的濃度。

標本收集:

1.       血清：全血標本于室溫放置2小時或4℃置夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

2.       血漿：抗凝劑推薦使用EDTA.Na2，標本采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂標本。

3.       組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，以去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣本對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。zui后將勻漿液于5000×g 離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.       細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

5.       其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測

（具體處理方法可參考：http://www.elabscience。。ｃｎ/news2.asp?tid=477 ）

6.       標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7.       標本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃/-80℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融，1-6月內(nèi)檢測,4℃保存的應在1周內(nèi)進行檢測。

8.       如果您的樣本中檢測物濃度高于標準品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋(建議先做預實驗，以確定稀釋倍數(shù))。

試驗所需自備物品:

1. 酶標儀(450nm波長濾光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙

檢測前準備工作:

1. 請?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。
3. 標準品: 加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為20ng/mL)。然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度： 20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0 ng/mL ，樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制10ng/mL標準品：取0.5mL 20ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。
4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。
   1. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制  100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。當日使用。

洗滌方法:

1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。

操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μL，余孔分別加標準品或待測樣品100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育90分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液100μL（在使用前15分鐘內(nèi)配制），酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。
3. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
4. 每孔加酶結合物工作液（臨用前15分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。
5. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)100μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止）。
7. 每孔加終止液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。
8. 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。
9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。

注意事項：

1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結果。

1. 酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。
2. 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。推薦設置復孔。
3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態(tài)；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4. 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數(shù)。
5. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小，運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用前1000轉/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液請根據(jù)所需用量配制，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時，一次不要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復凍融。
6. 顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免顏色過深影響酶標儀讀數(shù)。
7. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
8. 混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
9. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。
10. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）
11. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！

結果判斷:

1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
3. 若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性:

● 靈敏度：zui小可測0.19ng/mL。

● 檢測范圍：0.31 – 20ng/mL。

● 特異性：可檢測重組或天然的小鼠RUNX2，且與其它相關蛋白無交叉反應。

● 重復性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。

問題分析

說明

1. 限于現(xiàn)有條件及科學技術水平，尚不能對所有原料進行全面的鑒定分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質量技術風險。
2. zui終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關，請務必準備充足的待測樣品。
3. 只有全部使用Elab^TM試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守Elab^TM試劑的實驗說明才會得到*的檢測結果。
4. 有效期：6個月。
5. 本操作說明同樣適用于48T試劑盒。