細(xì)胞凋亡檢測方法

　　 細(xì)胞凋亡與壞死是兩種*不同的細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來。細(xì)胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。

一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測

　　根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。
　　 1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
　　 （1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
　　 （2） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
　　 2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
　　 一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。
　　 常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與　DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
　　 Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
　　 DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
　　 結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。

3 透射電子顯微鏡觀察
　　 結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

方法
　　 1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。
　　 2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。
　　 3 爬片細(xì)胞染色：同上，zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。

　注意事項
　　 1. 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞。
　　 2. 操作時注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一小時內(nèi)檢測。

三、線粒體膜勢能的檢測

　　線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中zui早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。
　　 線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。
　　 方法：將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細(xì)胞計檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
　　 注意事項
　　 1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。
　　 2． 與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四、DNA檢測

　　細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。
　　 1. 大分子染色體DNA測定
細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達(dá)到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。
　　 參考文獻(xiàn) Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
　　 2． DNA Ladder 測定
　　 方法：收獲細(xì)胞（1X107）沉淀?細(xì)胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4°C一夜?14000rpm′15min?zui后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。

3． 凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計分析
　　 方法：收集細(xì)胞，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定置夜，PBS洗滌，1000rpm′10min RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min，F(xiàn)ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測。

五 TUNEL法

　　細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。
六、Caspase-3活性的檢測

　Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，zui終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。
　　 1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
　　 方法：
　　 收集細(xì)胞→PBS洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C置夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2h或4°C置夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。

2 熒光分光光度計分析
　　 原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
　　 方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞，PBS洗滌，制備細(xì)胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應(yīng)1h，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長380nm，發(fā)射光波長為430-460nm）。

3 流式細(xì)胞術(shù)分析
　　 方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞?PBS洗滌，加Ac-DEVD-AMC 37°C反應(yīng)1h UV流式細(xì)胞計分析caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。

七、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上首先報導(dǎo)的一個擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。
　　 （一）TFAR19蛋白的細(xì)胞定位分析
　　 材料試劑：
FITC標(biāo)記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細(xì)胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。
　　 儀器：低溫水平離心機(jī), 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細(xì)胞計
　　 方法：
　　 1 懸浮細(xì)胞的染色：
　　 （1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　 （2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　 （3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　 （4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。
　　 （5）加入5ml FITC標(biāo)記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應(yīng)30min
　　 （6）熒光細(xì)胞洗液洗2次，1000rpm 10min。
結(jié)果觀察：將細(xì)胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時用流式細(xì)胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。

2：貼壁細(xì)胞的原位染色
　　 （1） 貼壁生長的對數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到
50%~80%滿時，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。
　　 （2） 將不同時間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。
　　 （3） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。

3：臨床病理切片的染色、檢測。
　　 4：原代細(xì)胞的培養(yǎng)、檢測。
　　 5：分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位
　　 （二）TFAR19蛋白的表達(dá)與臨床疾病
　　 1． ELISA法檢測正常人和疾病狀態(tài)下，以及疾病的不同時期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
　　 材料和試劑：
　　 1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
　　 2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
　　 3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）
　　 4. 酶標(biāo)抗體的稀釋：用封閉液稀釋
　　 5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
　　 6. 顯色液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
　　 7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標(biāo)記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm），洗板機(jī)
　　 操作步驟
　　 1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C置夜（一般24h以上）。
　　 2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
置夜。
　　 3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個重復(fù)孔）100ml/well ，37°C孵育1h。設(shè)包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
　　 4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標(biāo)記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
　　 5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應(yīng)10~15min。
　　 6. 加入H2SO4終止反應(yīng)，50 ml/well。
　　 7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達(dá)水平。
　　 8. Western blot 分析原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的TFAR19蛋白的表達(dá)水平。