慧穎生物淺談細(xì)胞破碎技術(shù)

1引言：

自年代初重組技術(shù)得到廣泛應(yīng)用以來，生物技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍, 生物產(chǎn)品的數(shù)量越來越多，許多具有重大應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，如具有顯著醫(yī)療作用的胰島素、干擾素、生長激素、白細(xì)胞介素一等, 它們的基因分別在宿主細(xì)胞如（大腸桿菌或酵母細(xì)胞）內(nèi)克隆表達(dá)成為基因工程產(chǎn)物，從而提高了產(chǎn)量，降低了成本。很多基因工程產(chǎn)物都是胞內(nèi)物質(zhì)如上述藥物經(jīng)克隆表達(dá)后都屬胞內(nèi)物質(zhì)，分離提取這類產(chǎn)物時(shí)，必須將細(xì)胞破壁，使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提取。因此細(xì)胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵性步驟，破碎技術(shù)的研究更加引起基因工程專家和生化工程學(xué)者的關(guān)注。

2 細(xì)胞破碎技術(shù)的概述：

細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。 結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細(xì)胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。細(xì)胞的機(jī)械破碎主要有高壓勻漿法、珠磨法、撞擊破碎法和超聲波破碎法等方法，本文主要介紹高壓勻漿法和珠磨法。

3 高壓勻漿法：

高壓勻漿法是大規(guī)模破碎細(xì)胞的常用方法，高壓勻漿器是該法所采用的設(shè)備，它由高壓泵和勻漿閥組成。它是利用高壓迫使懸浮液通過針形閥，由于突然簡壓和高速?zèng)_擊撞擊造成細(xì)胞破裂，在高壓勻漿器中，細(xì)胞經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞和由高壓到常壓的突變，從而造成細(xì)胞壁的破壞，細(xì)胞膜隨之破裂，胞內(nèi)產(chǎn)物得到釋放。

3.1破碎機(jī)理

同所有的機(jī)械破碎方式一樣，高壓勻漿法破碎細(xì)胞實(shí)質(zhì)上是將細(xì)胞壁和膜撕裂，靠胞內(nèi)的滲透壓使其內(nèi)含物全部釋放出來。破碎的難易程度無疑由細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度決定，而細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度則由微生物的形態(tài)和生理狀態(tài)決定。因此細(xì)胞的培養(yǎng)條件, 包括培養(yǎng)基限制型或復(fù)合型、生長期對(duì)數(shù)期、靜止期、稀釋率等, 都對(duì)細(xì)胞破碎有影響胞內(nèi)物質(zhì)的釋放快慢則由內(nèi)含物在胞內(nèi)的位置決定，胞間質(zhì)的釋出先于胞內(nèi)質(zhì)，而膜結(jié)合酶加zui難釋放。

3.2影響因素

影響高壓勻漿破碎的因素主要有壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)。人們普遍關(guān)心的是活性物質(zhì)在破碎過程中的失活問題，研究表明蛋白質(zhì)和酶的失活主要由勻漿過程中產(chǎn)生的熱引起的。如果能將溫度控制在35℃以下，那么酶活損失可以忽略。對(duì)于溫度敏感性物質(zhì), 低溫操作是必需的。高壓勻漿一般需多級(jí)操作，每次循環(huán)前往往進(jìn)行級(jí)間冷卻。盡管提高壓力有利于細(xì)胞破碎，但是提高壓力需增加能耗，同時(shí)為移走產(chǎn)生的熱量需要付出代價(jià)。高壓勻漿法的能耗主要包括提供動(dòng)力如壓力消耗的能量以及低溫操作耗費(fèi)的能量。此外，操作壓力對(duì)細(xì)胞破碎的影響要比勻漿次數(shù)的影響大得多。從提高破碎效率的角度應(yīng)選擇盡可能高的壓力；而從降低能耗及延長設(shè)備壽命的角度應(yīng)避免很高的壓力。因此，工業(yè)生產(chǎn)中常采用的壓力為55~70Mpa。

3.3存在問題

    除了較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌以及較小的革蘭氏陽性菌不適于用高壓勻漿器處理以外, 其它微生物細(xì)胞都可以用高壓勻漿法破碎。另外有些亞細(xì)胞器如包含體，質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。但zui近也有人在實(shí)驗(yàn)室嘗試用高壓勻漿器破碎真菌和含有包含體的大腸桿菌。

4 珠磨法：

珠磨法是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。球磨破碎細(xì)胞的破碎率可高達(dá)95%，用于提取細(xì)胞壁，線粒體，核酸，蛋白以及其它細(xì)胞器的收率也高。用Dyno mill破碎酵母細(xì)胞提取線粒體的收率要比其它機(jī)械破碎法要高5-8倍。球磨破碎細(xì)胞應(yīng)用范圍廣，從實(shí)驗(yàn)室到大規(guī)模生產(chǎn)均可使用，并可控制系統(tǒng)及破碎工藝過程的溫度；操作系統(tǒng)密閉，可對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行滅菌，避免污染。因此，該技術(shù)和設(shè)備的發(fā)展和應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。

4.1破碎機(jī)理

高速珠磨法也是一種有效的細(xì)胞破碎方法，珠磨機(jī)是該法所用的設(shè)備。微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑通常是直徑的無鉛玻璃珠在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞壁破裂,釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。

4.2相關(guān)設(shè)備

4.2.1球磨容器

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的容積為0.15、0.3和0.6升，工業(yè)規(guī)模的為1.4升到15升，zui大的可達(dá)265升，為帶有冷卻夾套的圓桶容器，小型的實(shí)驗(yàn)室使用的是無鉛玻璃制造，而大型的是不銹鋼制造。有通向容器內(nèi)部的菌懸液進(jìn)料口和球磨劑裝料口。依靠夾具將其固定，很容易更換。

4.2.2驅(qū)動(dòng)馬達(dá)

    驅(qū)動(dòng)馬達(dá)為三相380 V，1.85 KW，2900 rpm的電動(dòng)馬達(dá)。其主動(dòng)輪通過一個(gè)特殊的V型皮帶與攪動(dòng)軸上的被動(dòng)輪連結(jié)，利用安裝在操作馬達(dá)開關(guān)板上的手柄，控制皮帶在主動(dòng)輪和被動(dòng)輪上的位置，改變攪動(dòng)速度。分別達(dá)到2000，3000，4500和6000轉(zhuǎn)/秒，這時(shí)的攪拌葉的線速度分別為6.7，10，15和20米/秒。

4.2.3電動(dòng)馬達(dá)的控制

控制馬達(dá)的開關(guān)有兩個(gè)按鈕，開和關(guān)，安培表，信號(hào)燈，在防護(hù)罩上有磁性開關(guān)，一當(dāng)防護(hù)罩打開，或在操作時(shí)未關(guān)上，電動(dòng)馬達(dá)不能啟動(dòng)。

4.2.4攪拌葉

由聚氨酯或不銹鋼制造的直徑為64毫米的圓盤，它們是用墊片和分離子按一定間隔距離將其固定在攪動(dòng)軸上。

4.2.5分離器

為一種狹縫分離器，它的作用是將研磨劑保留在研磨容器內(nèi)，而使破碎的細(xì)胞懸浮液流出。狹縫的寬度是利用不同厚度的標(biāo)準(zhǔn)隔片控制，分別為0.02，0.05，0.1，0.2和0.3 mm。狹縫大小的選擇取決于使用的研磨劑的粒度，一般為研磨劑直徑的三分之一。

4.2.6球磨劑

 球磨劑為無鉛玻璃制造的玻璃珠，直徑范圍zui小的為0.1mm，zui大的為1.5mm，可根據(jù)破碎的細(xì)胞種類進(jìn)行選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在球磨容器內(nèi)的球磨劑裝量為研磨容器的容積的80-85%為宜。

4.2.7給料泵

為了連續(xù)破碎，可使用能調(diào)速的普通蠕動(dòng)泵，將細(xì)胞懸浮液連續(xù)輸?shù)狡扑槠鲀?nèi)，其供料速度可由需要的破碎率來控制。

4.2.8冷凍設(shè)備

由于在細(xì)胞破碎過程中高速攪拌，研磨劑與研磨劑，研磨劑與細(xì)胞之間的磨擦?xí)a(chǎn)生大量熱量，破碎過程溫度不斷升高，為避免生物活性物質(zhì)失活，對(duì)破碎系統(tǒng)進(jìn)行冷卻是十分必需的。對(duì)于Dtno-mill KDL可配用DMK 15/F型的循環(huán)流動(dòng)式制冷機(jī)，對(duì)球磨容器和細(xì)胞懸浮液儲(chǔ)存器進(jìn)行冷卻。

4.3影響因素

4.3.1細(xì)胞種類及狀態(tài)

利用Dyno-mill KDL進(jìn)行的細(xì)胞破碎試驗(yàn)表明，不同中屬的微生物細(xì)胞在相同條件下破碎時(shí)，其破碎效率有明顯差異。差異的主要原因是不同種屬的微生物細(xì)胞的大小和形態(tài)，細(xì)胞壁或膜的結(jié)構(gòu)不同，另外，因生長條件如培養(yǎng)溫度，時(shí)間，營養(yǎng)成份不同使上述的細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等也有差別。因此，即使在相同的破碎條件下其破碎效果也不同。換句話說，不同種屬的微生物細(xì)胞所需的破碎條件也不相同。從大量文獻(xiàn)中可以總結(jié)出這樣的規(guī)律：按細(xì)胞破碎的難易程度是細(xì)菌＜酵母＜真菌＜藻類。

4.3.2細(xì)胞濃度

在細(xì)胞破碎前，需用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)，比如緩沖液按細(xì)胞重量配制成一定細(xì)胞濃度的懸浮液。懸浮液要均勻，要防止有結(jié)塊和沉淀。一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的速成常數(shù)應(yīng)當(dāng)與細(xì)胞濃度無關(guān)，但在較高細(xì)胞濃度下，破碎過程細(xì)胞內(nèi)含物不斷釋放使系統(tǒng)粘度不斷升高，混合速度降低，導(dǎo)致破碎速率下降。在高細(xì)胞濃度下，zui大蛋白質(zhì)釋放量(Rm)降低，但破碎率高。低細(xì)胞濃度下，細(xì)胞的總蛋白質(zhì)釋放量高，并受流出速度影響較?。桓呒?xì)胞濃度下，細(xì)胞的總蛋白質(zhì)釋放量降低，特別是在高流出速度下，總蛋白質(zhì)釋放量隨細(xì)胞濃度增加而下降。

除了細(xì)胞濃度直接影響破碎物的粘度以外，細(xì)胞的保存狀態(tài)也影響著粘度和破碎率。細(xì)胞破碎過程中，由于粘度增加，熱傳導(dǎo)能力降低，即使在相同的冷卻條件下，破碎系統(tǒng)的溫度也會(huì)增高，溫度的增高會(huì)引起蛋白質(zhì)和酶變性，使蛋白質(zhì)和酶的總釋放量降低。

總之，在Dyno-mill上進(jìn)行細(xì)胞破碎，細(xì)胞濃度從20%增加到40%，破碎速度常數(shù)僅有很小的變化;細(xì)胞濃度增加到50%，破碎速度常數(shù)減小，破碎效率降低。高細(xì)胞濃度下，還會(huì)發(fā)生細(xì)胞破碎物沉淀和蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象．一般來說，破碎細(xì)胞濃度以40%為宜。

4.3.3球磨劑

zui常使用的球磨劑是無鉛玻璃珠，其它的還有不銹鋼珠，聚酯和聚酰胺珠等。

4.3.3.1 球磨劑顆粒大小的影響

一般使用的無鉛玻璃珠的直徑為0.1~1.5 mm，利用大腸桿菌和酵母細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞破碎率隨玻璃珠直徑的增加而降低。對(duì)于不同的細(xì)胞，由于其大小不同，使用的玻璃珠的zui適直徑也不同。大腸桿菌和陰溝腸桿菌使用0.1 mm的玻璃珠進(jìn)行破碎的效率zui高；而酵母細(xì)胞使用0.25~0.5 mm的研磨劑zui宜。

實(shí)際操作時(shí)，一般不使用0.1 mm的球磨劑，即使破碎細(xì)菌也使用0.25~0.5 mm的玻璃珠。其原因有三：一、用0.1 mm的玻璃珠破碎速度雖高，時(shí)間短，若破碎時(shí)間控制不嚴(yán)，對(duì)酶有破壞作用，破碎物的酶活會(huì)下降；二、小珠機(jī)械研磨產(chǎn)生熱量高；三、選擇狹縫分離器時(shí)，狹縫的大小應(yīng)當(dāng)是使用的研磨劑直徑的三分之一，使用0.1 mm的玻璃珠，狹縫應(yīng)選用0.03 mm的，這樣的狹縫分離很慢，大規(guī)模破碎時(shí)很困難。玻璃珠作球磨劑，使用100 h的損失不超過3%，一年后檢查分離器通道無重大變化，說明玻璃珠可以長期反復(fù)使用。還發(fā)現(xiàn)使用的玻璃珠大小與酶在細(xì)胞內(nèi)的位置及細(xì)胞濃度有關(guān)。

4.3.3.2裝量的影響

使用無鉛玻璃珠作球磨劑，一般的裝量為研磨容器容積的80~85%。隨球磨劑裝量的降低，細(xì)胞破碎效率也降低，同時(shí)研磨過程中產(chǎn)生的熱量也減少。因此，如果破碎釋放的活性物質(zhì)不耐熱，而且設(shè)備冷卻又差，需適當(dāng)減少球磨劑的裝量。另外，若細(xì)胞懸浮液或破碎物的粘度很高時(shí)，也需適當(dāng)降低球磨劑的裝量。

4.3.4攪動(dòng)速度

 Dyno-mill 的攪動(dòng)軸有四個(gè)轉(zhuǎn)速，即2000，3000，4500和6000 r/min，相應(yīng)的攪拌葉輪的線速度為6.9，10，15和20 m/s。

在球磨細(xì)胞破碎過程中，馬達(dá)驅(qū)動(dòng)軸帶動(dòng)攪拌葉轉(zhuǎn)動(dòng)是細(xì)胞破碎的維一能量來源。因此，攪拌葉的轉(zhuǎn)速?zèng)Q定著細(xì)胞破碎的速度和程度。大多數(shù)試驗(yàn)證明，細(xì)胞破碎速率隨攪拌葉轉(zhuǎn)速的增加而增加，但在很高的轉(zhuǎn)速下細(xì)胞破碎速率不會(huì)成比例增加，有時(shí)還可能下降。

4.3.5葉輪結(jié)構(gòu)

經(jīng)常使用的攪動(dòng)葉輪有兩種，一種是由聚氨基甲酸酯材料制造，具有開放式的結(jié)構(gòu)；另一種是用不銹鋼制造的，結(jié)構(gòu)上不如聚氨基甲酸酯的開放。不同材質(zhì)和結(jié)構(gòu)的攪動(dòng)葉輪在操作中因攪動(dòng)效果的差異，使破碎系統(tǒng)的溫度變化也不同。在低轉(zhuǎn)速下，較開放的聚氨酯葉輪的破碎效率較低，這是由于反逆作用所造成的。在高轉(zhuǎn)速下，有較高的攪動(dòng)效率，且能耗也增加。

為增加攪動(dòng)效率，可以使攪拌葉安裝成與軸有一定角度，其作用是增加分散能力，但這樣會(huì)使連續(xù)破碎的能力減??；因增加了能量到細(xì)胞懸浮液中的傳遞能力，而有較高的破碎速度，但能量效率降低，特別是在高轉(zhuǎn)速下。

4.3.6流速

細(xì)胞破碎與攪動(dòng)速度有關(guān),在高攪動(dòng)速度下，流速的變化對(duì)細(xì)胞破碎率影響較小，而在低的攪動(dòng)速度下，流速對(duì)破碎率的影響較大。

4.3.7溫度

目前還沒有溫度對(duì)破碎過程影響的詳細(xì)研究報(bào)告，由于破碎為產(chǎn)熱過程，直接影響破碎物的粘度及酶的活性和蛋白質(zhì)總量的釋放，一般來說，破碎溫度越高，細(xì)胞蛋白質(zhì)的釋放量越低。

5 兩種方式的比較：

    高壓勻漿法同高速珠磨法相比各有特點(diǎn), 間歇處理少量樣品時(shí), 勻漿法優(yōu)于珠磨法。前者操作參數(shù)少, 易于確定,而且樣品損失量少, zui少可處理20ml懸浮液。珠磨機(jī)操作參數(shù)多, 一般憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì), 并且珠子之間的液體損失使一次處理懸浮液zui終只能得到左右的漿液。連續(xù)操作時(shí)珠磨機(jī)顯示出*性, 首先它兼具破碎和冷卻雙重功能, 減少了產(chǎn)物失活的可能性, 而高壓勻漿器需配備換熱器進(jìn)行級(jí)間冷卻其次珠磨法破碎效率高, 在適當(dāng)條件下一次操作就能達(dá)到較高的破碎率, 而高壓勻漿法往往需循環(huán)一次才行再者幾乎所有種類的微生物細(xì)胞都可以用珠磨機(jī)破碎, 包括含有包含體的基因工程菌的破壁, 質(zhì)地堅(jiān)硬的包含體可以充當(dāng)研磨劑, 更有利于細(xì)胞破壁, 而高壓勻漿器則有一定的局限性。

6 細(xì)胞破碎技術(shù)研究的發(fā)展方向：

6.1多種破碎方法相結(jié)合

化學(xué)法與酶法取決于細(xì)胞膜壁的化學(xué)組成，機(jī)械法取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，而化學(xué)組成又決定了結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，組成的變化必然影響到強(qiáng)度的差異，這就是化學(xué)法或酶法與機(jī)械法相結(jié)合的原理。

6.2與上游過程相結(jié)合

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)如、溫度、通氣量、稀釋率等因素對(duì)細(xì)胞破碎都有影響，因此細(xì)胞破碎與上游培養(yǎng)有關(guān)。另一方面用基因工程的方法對(duì)菌種進(jìn)行改造也是非常重要的。這方面的工作包括以下幾個(gè)方面：包含體的形成、克隆噬菌體溶解基因、耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)。

6.3與下游過程相結(jié)合

細(xì)胞破碎與固一液分離緊密相關(guān)，對(duì)于可溶性產(chǎn)品來講，碎片必須除凈，否則將造成層析柱和超濾膜的堵塞，縮短設(shè)備的壽命。因此必須從后分離過程的整體角度來看待細(xì)胞破碎操作，機(jī)械破碎操作尤其如此。

7 總結(jié)：

細(xì)胞破碎技術(shù)的發(fā)展極大程度上也推動(dòng)了細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物工業(yè)化的生產(chǎn)。在運(yùn)用細(xì)胞破碎方法時(shí)，要分析實(shí)際需求、結(jié)合前人經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也可多種方法結(jié)合使用，以求達(dá)到性價(jià)比zui大化。

慧穎生物常備各種細(xì)胞株細(xì)胞系，有需要的老師請(qǐng)來電/