小鼠_TNF-α_elisa試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml

zui低檢測限：7.8 pg/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的小鼠TNF-α，且與其他相關蛋白無交叉反應。

有效期：6 個月

預期應用：ELISA 法定量測定小鼠血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中TNF-α

含量。

說明

1．試劑盒保存：-20℃(較長時間不用時)；2-8℃(頻繁使用時)。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任

何影響。

概述

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一種具有多種生物活性的細胞因子。兔子TNF-α

基因編碼前體蛋白，其信號肽將前體蛋白固定在細胞膜上，成為具有活性的跨膜干擾素

(TNF)，分子質量為26×103，經酶切去除信號肽生成分泌型TNF-α，分子質量為17×103。

TNF-α細胞來源廣泛，包括各種免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、角質細胞、

平滑肌細胞、星形細胞、成骨細胞等。

TNF-α具有廣泛的生物學活性，如：參與炎性反應和免疫應答，抗腫瘤，參與內毒素性休

克等病理過程，引起惡病質等。其具有雙重作用，,一方面在機體免疫調節(jié)，機體生理功能

和抗感染等方面發(fā)揮重要作用，另一方面若持續(xù)釋放或產生過多則會引起發(fā)熱!、休克、惡

病質等，同時TNF-α可進一步誘導IL-6、IL-8、IL-10 等細胞因子的產生，這些促炎性細胞

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因子參與體內急性反應、發(fā)熱反應、引起趨化肽釋放等，還可使內皮細胞活化而導致血管通

透性增加。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗TNF-α抗體的微孔中依次加入標本或標

準品、生物素化的抗TNF-α抗體、HRP 標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB 顯色。

TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺

和樣品中的TNF-α呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃

度。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊(96 孔)。

2. 標準品(Standard)：2 瓶(凍干品)。

3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4. 生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。

5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。

6. 生物素標記抗體(Biotin-antibody)：1×120ul/瓶(1：100)

7. 辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin)：1×120ul/瓶(1：100)

8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。

9. 濃洗滌液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

10. 終止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標準規(guī)格酶標儀

2. 高速離心機

3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱

4. 干凈的試管和Eppendof 管

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5. 系列可調節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6. 蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存

1. 血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃一夜后于1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可

檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內于2 - 8° C 1000 x g 離心15

分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或將標本

放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準

曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度

時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。

標準品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，

然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為2000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋2000

pg/ml，1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，樣品稀釋液

直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15 分鐘內配制。

如配制1000 pg/ml 標準品：取0.5ml(不要少于0.5ml)2000 pg/ml 的上述標準品加入含0.5ml

樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

生物素標記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制

(每孔100ul)，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul 生物素標記抗體加990ul 生物素標

記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：

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臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的

總量配制(每孔100ul)，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul 辣根過氧化物酶標記親和

素加990ul 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內

配制。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。

每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試

劑盒的檢測范圍。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標

準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，

輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120 分鐘。

為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100ul(取1ul 生物素標記抗

體加99ul 生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制)，37℃,60

分鐘。

3. 溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔，甩干。

4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(同生物素標記抗體工作液) 100ul，37℃，60

分鐘。

5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔，甩干。

6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色(30 分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4 孔

有明顯的梯度藍色，后3-4 孔梯度不明顯，即可終止)。

7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(此時藍色立轉黃色)。終止液的加入順序應盡量與

底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度(OD 值)。在加終止液后15 分鐘以內進

行檢測。

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注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。

測量時先用此孔調OD 值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過

氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生

物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法

手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，

酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需

要，重復此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標)，OD 值為縱坐標(普通坐標)，在半對數(shù)坐標紙上

繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準

物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出

樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間控制在5 分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

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6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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