組份

數(shù)目

細(xì)胞

 1 T-25瓶

細(xì)胞說(shuō)明書(shū)

一份

生長(zhǎng)特性：

懸浮生長(zhǎng)

培養(yǎng)條件：

培養(yǎng)基：90%1640 +10%FBS（推薦HAKATA優(yōu)等胎牛血清 貨號(hào)：HN-FBS-50）

氣相：空氣95%，二氧化碳5%

溫度：37℃

培養(yǎng)：

一、貼壁細(xì)胞

1.用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒，將其平躺置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行2-3小時(shí)的緩沖，.然后置于無(wú)菌操作臺(tái)，打開(kāi)瓶口，將其中的培養(yǎng)液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)基顏色變化對(duì)其進(jìn)行換液以及傳代；

2.待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底面積80%-90%，需要對(duì)其進(jìn)行傳代，次傳代比例為1:2。

3傳代步驟：將0.25%含EDTA胰酶置于37°預(yù)熱，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，往培養(yǎng)瓶中加入1mlPBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加1ml預(yù)熱好的胰酶，置于37°孵育消化（次消化需時(shí)常取出置于顯微鏡下觀(guān)察，以顯微鏡下細(xì)胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見(jiàn)細(xì)胞脫落為zui佳消化時(shí)間，記錄zui佳消化時(shí)間，以便于下次消化），消化好后加入1ml*培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之*脫落，然后收集細(xì)胞懸液，1200rpm離心3min，棄上清，加入*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代。

二、懸浮細(xì)胞

1.用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒，然后置于無(wú)菌操作臺(tái)，打開(kāi)瓶口，輕輕吹打后，將其中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，然后1200rpm離心3min，去上清；

2.將離心好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T-25瓶中，并加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基，然后將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)基顏色變化對(duì)其進(jìn)行換液（離心后去舊液，加入新鮮培養(yǎng)基）；

3.顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞數(shù)目比較多時(shí)，對(duì)其進(jìn)行傳代，次傳代比例為1:2（離心后平均分成兩瓶培養(yǎng)）。

細(xì)胞總數(shù)：

1~3*10⁶

傳代周期：

2-3天

傳代比例：

1:2~1：3

換液頻率：

2-3天

凍存液：

90%FBS+10%DMSO